中国农业科学院研究生，中国农业科学院研究生院
酶解法制备的骨胶原蛋白肽为混合肽，通常具有抗高血压、抗骨质疏松、抗氧化和促进伤口愈合等多种潜在的生理功能。影响肽生物活性的主要因素包括一级结构（氨基酸的排列和组成）和肽链长度等，例如牦牛骨胶原蛋白肽GPAGPPGPIGPV（GP-12）能显著促进成骨细胞增殖，而GPAGPAGPR（GP-9）和GEKGETGLR（GE-9）对成骨细胞增殖起抑制作用。
牦牛是我国珍贵的畜牧资源，牦牛屠宰产生的骨副产物质量约占胴体质量的20%～30%，但综合利用却严重不足，现已证实牦牛骨胶原蛋白肽具有良好的成骨活性，能显著改善去卵巢骨质疏松大鼠模型症状。中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室的陈永凯、郭玉杰、张春晖*等采用酶法制备牦牛骨胶原蛋白肽，通过CDOCKER分子对接技术靶向筛选作用于EGFR的促成骨细胞增殖活性肽段，基于体外细胞增殖培养验证其活性并阐释与EGFR的结合机制，以期为促成骨细胞增殖活性肽的靶向筛选和工业化制备提供理论参考。
1、牦牛骨胶原蛋白肽分子质量分布
如图1所示，分子质量小于3 000 Da的肽段占91.8%，其中小于1 000 Da的占69.2%，说明该批肽粉符合国家标准。
研究发现，低分子质量的牛骨胶原蛋白肽（＜3 000 Da）、牦牛骨胶原蛋白肽（＜3 000 Da）以及猪骨胶原蛋白肽（＜1 000 Da）均能显著促进MC3T3-E1细胞增殖，发挥成骨活性。因此，本实验制备的牦牛骨胶原蛋白肽可能具有开发成为抗骨质疏松功能食品的潜在价值，故进行后续实验。
2、牦牛骨胶原蛋白肽序列分析
结果可知，本实验中从牦牛骨胶原蛋白肽中共鉴定得到78 条肽段，其中I型胶原蛋白肽占比为82.0%，来源于α 1 链和α 2 链的肽分别占I型胶原蛋白肽总量的45.3%和54.7%，并且其序列均与胶原蛋白的（Gly-X-Y） n 特征序列相吻合，表明鉴定结果具有较高的可靠性。
3、分子对接实验结果
将鉴定的多肽与EGFR对接后，-CE的变化范围从21.493 kcal/mol到170.507 kcal/mol，其中阳性肽GD-18和GP-16的-CE分别为134.759 kcal/mol和132.988 kcal/mol。-CE比阳性肽高20 kcal/mol以上的多肽共有5 条，分别为GP-18（162.390 kcal/mol）、TP-14（167.276 kcal/mol）、GK-21（170.507 kcal/mol）、GK-22（162.093 kcal/mol）和GP-17（156.133 kcal/mol），除TP-14来源于β-乳球蛋白以外，其余均来自于I型胶原蛋白的α 1 链。
4、促成骨细胞增殖活性分析
如图2所示，将细胞在多肽质量浓度分别为0.1、0.5、1.0 mg/L和3.0 mg/mL条件下分别培养48 h，发现当质量浓度不低于1.0 mg/mL时，所有多肽均无显著的促MC3T3-E1细胞增殖活性，GP-17、GP-18和TP-14甚至能抑制细胞增殖；当质量浓度为3.0 mg/mL时，GK-22能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖（相对增殖率为106%），并且表现出剂量-效应关系，说明GK-22序列可能是促进MC3T3-E1细胞增殖的特征性序列，具有潜在的研究价值。值得注意的是，GK-21的序列仅与GK-22相差一个末端Gly残基，却无显著的促增殖活性，因此末端Gly残基对GK-22的促成骨细胞增殖具有重要意义。
5、不同多肽与EGFR的结合机制
如图所示，GK-22与EGFR的非键相互作用主要为氢键和疏水相互作用，可与EGFR的Lys13、Leu14和Thr15形成5个氢键（包括常规氢键和碳氢键，与Lys13和Thr15各形成2个氢键），与Leu17和His409分别形成烷基相互作用和π-烷基相互作用。同时，阳性肽GP-16也与EGFR的Lys13和Thr15形成氢键；GD-18与Thr15形成氢键，与Leu17和His409形成烷基相互作用，提示GK-22可能与两者存在相似的促成骨细胞增殖机制。而分子对接结果表明GK-21与EGFR的亲和力高于GK-22，并且可与Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Tyr45和Gln384形成氢键，与Leu17、Leu325、His346和His409形成疏水相互作用，除Lys13外，涵盖了GK-22与EGFR的所有结合位点，却未与GK-22一样表现出促增殖活性，原因有待进一步研究。GP-17、GP-18和TP-14与EGFR的非键相互作用除氢键和疏水相互作用外，还包括静电相互作用。GP-17与EGFR形成8个氢键、1个电荷相互作用、1个烷基相互作用；其中EGFR的Asp355残基与之形成4个氢键（含2个碳氢键、1个常规氢键、1个盐桥）、1个电荷相互作用，是两者结合的关键氨基酸残基。GP-18与EGFR形成9个氢键、1个π-烷基相互作用、1个电荷相互作用；TP-14与EGFR形成10个氢键，1个π-阳离子相互作用、1个烷基相互作用。
结 论
骨胶原蛋白经复合酶酶解可获得低分子质量（＜3 000 Da）的混合肽，但发挥促成骨细胞增殖活性的肽序列尚不明确。本研究采用nano LC-MS/MS技术测定混合肽序列，以牦牛骨胶原蛋白肽GD-18和GP-16为阳性对照，通过CDOCKER半柔性对接技术筛选获得具有潜在促成骨细胞增殖活性的牦牛骨胶原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22，体外细胞增殖培养实验进一步表明，GK-22可通过与EGFR结合，发挥促成骨细胞增殖活性。综上，基于以EGFR为受体的CDOCKER半柔性对接技术，可实现促成骨细胞增殖活性骨胶原蛋白肽的靶向筛选。
本文《促成骨细胞增殖活性骨胶原蛋白肽的靶向筛选及活性分析》来源于《食品科学》2022年43卷13期1-7页，作者：陈永凯，郭玉杰，张鸿儒，刘泓，张春晖，姜珊。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210327-339。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及百度图片。
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中国农业科学院研究生(中国农业科学院研究生院)
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